¿En qué consiste una PCR?

La reacción en cadena de la polimerasa (la famosa PCR) es una técnica que se utiliza para “amplificar” pequeñas cantidades de ADN. La sigla PCR viene del nombre en inglés de la técnica: Polymerase Chain Reaction. El material genético en pequeña cantidad resulta invisible para los métodos de análisis, incluso los más modernos,  por lo que es necesario realizar copias, muchas muchas copias (de ahí el verbo “amplificar”) para poder estudiarlo o detectarlo. Te explicamos un poco más detalladamente esta técnica, tan rompedora que recibió el premio Nobel de química del año 1993.

¿Qué es la reacción en cadena de la polimerasa?

Es la repetición sucesiva de una reacción química en la que se aprovecha una enzima llamada polimerasa para generar más ADN a partir de una muestra de material genético original. Para entenderla bien tenemos que conocer unos detalles del ADN previamente, así que empecemos por el principio.

El ADN es una macromolécula, es decir, una molécula gigante, compuesta de unidades más pequeñas llamadas “nucleótidos”. Los nucléotidos se unen químicamente para formar una hebra, y dos hebras complementarias son capaces de unirse y torcerse sobre sí mismas para formar una doble hélice. Entre otras propiedades del ADN contamos con:

• La doble hélice se abre al calentarse, y se obtienen dos hebras simples de nucleótidos.
• Cada una de esas hebras puede servir de molde para la hebra compañera que forma la doble hélice, pues son hebras perfectamente complementarias. Esta propiedad permite que el ADN sea “autocopiante” con las enzimas de síntesis adecuadas, siendo una de la más importante la enzima llamada ADN polimerasa.
• La ADN polimerasa puede copiar una hebra utilizando nuclétidos individuales sueltos como si fuera un albañil que hace una pared a partir de ladrillos, pero necesita al menos tener un trocito de hebra complementaria disponible para comenzar a sintetizar una nueva hebra. A este trocito lo llamamos primer.

La reacción en cadena de la polimerasa aprovecha estas propiedades para obtener una buena cantidad de material genético a partir de pocas (o incluso una) dobles hélices.

¿Cómo funciona la reacción en cadena de la polimerasa?

Supongamos que partimos de una sola cadena doble de ADN encontrada en una muestra biológica (sangre, piel, secreciones nasales, etc.). A esta muestra podemos añadirle polimerasa, primers y nucléotidos, y llevar a cabo los siguientes pasos con un equipo automatizado:

• Calentamiento de la muestra a una temperatura tal que se abra la doble hélice pero no se destruya (90-95ºC).
• Enfriamiento ligero del medio de reacción, para que se unan las hebras simples con los primers disponibles en el medio.
• Síntesis de una nueva cadena complementaria a las anteriores. Esto se realiza a través de polimerasas capaces de tolerar el calentamiento y de trabajar a 60-75ºC , como la polimerasa proveniente de los microorganismos Thermus aquaticus (TaqDNA polimerasa, la primera en usarse) o Pyrococcus furiosus (PfuDNA polimerasa, un poquito mejor copiando que la primera).

Al finalizar estos pasos, en vez de una doble cadena de ADN tenemos dos cadenas de ADN, pues cada hebra se usó como molde para una nueva doble hélice. Si añadimos a este ciclo otro igual, en vez de cuatro cadenas tendremos ocho. Y si encadenamos muchos ciclos (“reacción en cadena”) obtendremos una cantidad importante de ADN con el que podremos diagnosticar una infección, hacer una prueba de paternidad, encontrar al culpable de un asesinato, etc. Y si controlamos cuidadosamente las condiciones de reacción podemos tener una idea de cuánto material genético teníamos al empezar: en nuestro ejemplo, si necesitamos partimos de 50 dobles hélices de ADN necesitaremos un ciclo para llegar a 100 cadenas, pero si partimos de una sola necesitaremos varios ciclos (una hélice resulta en dos, dos resultan en cuatro, cuatro   resultan en ocho….y así sucesivamente).

¿Qué es la RT-PCR?

La RT-PCR  es una modificación de la técnica de la PCR  necesaria para trabajar con material genético de tipo ARN, como el que se encuentra en el virus Sars-CoV-2 o el VIH. La polimerasa sólo puede trabajar con ADN, por lo que necesitamos una enzima que sintetice una cadena de ADN complementaria a la cadena de ARN original; esta función la cumple la enzima llamada transcriptasa reversa. El primer paso de la RT-PCR es la síntesis del ADN complementario al ARN original y la destrucción del ARN, para luego hacer los mismos ciclos de la PCR explicados arriba.

El nombre RT-PCR viene del inglés reverse transcription – polymerase chain reaction.

 

¿Qué es la rRT-PCR?

La r minúscula es el símbolo de “real time”, es decir, “en tiempo real”. Es una modificación de la RT-PCR que permite hacer un seguimiento detallado de los ciclos de reacción y es muy útil para cuantificar el material genético de la muestra.

¿Qué limitaciones presenta la PCR?

La PCR y las técnicas relacionadas son muy fiables, pero presentan algunos inconvenientes:

• Requieren tiempo. Se requieren varias horas para obtener el resultado de un paciente, limitando la capacidad de un laboratorio para entregar resultados.
• Alta sensibilidad a la contaminación. Los laboratorios suelen trabajar en áreas separadas para la pre-amplificación y para la post-amplificación, pues la contaminación con poquitas hebras de ADN puede dar un falso positivo. La PCR suele hacerse junto con un control negativo (reacción sin material genético presente) que, si da positivo, delata una posible contaminación del sistema de reacción.
• Son costosas. El aparato que hace estas pruebas no es barato, los materiales para llevar a cabo la prueba tampoco son económicos y se requiere personal cualificado para operarlo e interpretar el resultado correctamente.

Es por eso que, en momentos críticos como puede ser la pandemia de covid-19, se han buscado opciones más rápidas y económicas a la PCR como los tests de antígenos, que están listos en 15 minutos y no requieren tanto equipo o instalaciones.